實(shí)驗條件的選擇

發(fā)布時(shí)間： 2022-07-20　　點(diǎn)擊次數： 534次

實(shí)驗條件的選擇
在ELISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1）　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應，觀(guān)察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時(shí)，觀(guān)察陽(yáng)性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。
（3）　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法"（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗系統里準確地滴定其工作濃度。
（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

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