大鼠內皮素(ET)酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

大鼠內皮素(ET)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用

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實(shí)驗目的：

本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中內皮素(ET)的含量。

實(shí)驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定大鼠標本中內皮素(ET)水平。用純化的內皮素(ET)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入內皮素(ET)，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過(guò)C底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的內皮素(ET)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中內皮素(ET)含量。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：
1、組織標本：對于樣本要求保持鮮重，稱(chēng)取樣本中的重量不小于50mg，一般以1g為基準,但不嚴格要求固定樣本每個(gè)重量必須達到相同的水平。勻漿的比例選取10%，相當于1g組織加9ml的勻漿液來(lái)進(jìn)行勻漿。勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）。勻漿過(guò)程選用組織勻漿器，冰浴上勻漿。(或者進(jìn)行液氮碾磨)，離心取上清，離心轉速選用5000轉每分，時(shí)間是15分鐘。取上清液待檢。

2-1、貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個(gè)細胞中加入150-200μL PBS重懸并通過(guò)反 復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

2-2超聲波破碎條件：用20kHz頻率，150W的功率，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，每破碎2s，間隔3s，反復破碎三次。

2-3反復凍融：收集細胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-20℃ 冷凍30 min，37℃解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液。

3、標本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻進(jìn)行，提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

4、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。

4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。

9. 測定：以空白孔調零，450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD值），測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)，根據樣品的OD值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開(kāi)封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

2. 濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn)，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物請避光保存。

7. 嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

技術(shù)提示：

1、混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。

2、加校準品與樣本時(shí)，每個(gè)校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗結果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會(huì )瞬間變?yōu)辄S色。

6、實(shí)驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說(shuō)明書(shū)標明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

8、檢測必須符合實(shí)驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進(jìn)行處置。

試劑盒性能：

1. 樣品線(xiàn)性回歸與預期濃度相關(guān)系數R值為0.95以上。

2. 批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

保存條件及有效期：

1. 試劑盒保存：2-8℃

2．有效期：6個(gè)月